A série gira em torno da vida de Johnny Test, um garoto de 11 anos vivente na fictícia cidade Porkbelly com seus pais e suas irmãs gêmeas Susan e Mary, das quais são cientistas. Susan e Mary por serem cientistas vivem fazendo diversos experimentos dos quais Johnny é usado como "cobaia" para testá-los (daí o significado de seu sobrenome). Além disso Johnny também encara várias aventuras junto de seu cão falante Dukey contra os mais variados vilões com o auxílio das invenções de suas irmãs.
O maior rival de Johnny é Bling Bling Boy, um garoto rico e gênio que faz de tudo para impressionar sua irmã Susan, apesar desta sempre o ignorar por estar sempre tentando impressionar seu vizinho Gil junto de sua irmã Mary, apesar dele nunca dar atenção a elas como se nem notasse suas existências. Além de Bling Bling, Johnny possui outra rival de escola chamada Sissy, da qual sempre tenta ser melhor que ele em tudo, apesar de ambos terem um amor secreto um pelo outro. Dois grandes aliados de Johnny são os agentes Sr. Claro e Sr. Moreno que resolvem casos numa base secreta e sempre pedem ajuda as irmãs em suas missões.
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PERSONAGENS
Jonathan "Johnny" Test - Protagonista da série. Um garoto de 11 anos com um cabelo loiro similar a labaredas de fogo bastante aventureiro, encrenqueiro e bagunceiro. É frequentemente usado como cobaia de suas irmãs em suas experiências muitas vezes em troca de que elas façam inventos pra satisfazer sua vontade. Seu maior parceiro é Dukey, seu cão (falante) de estimação
.
Dukey - Cão de estimação falante de Johnny. Age feito um ser humano por ter tido seu DNA alterado por Susan e Mary, e por isso ninguém (além de Johnny, Susan e Mary) sabem que ele fala. Dukey é bastante folgado e malandro e sempre se aproveita da pouca inteligência de Johnny para satisfazer as suas vontades.
Susan e Mary Test - Irmãs gêmeas cientistas de Johnny. Possuem 13 anos e vivem num laboratório montado no sótão de sua casa e vivem fazendo experiências, a maioria para impressionar seu vizinho bonitão Gil. Sempre usam seu irmão Johnny como cobaia de seus experimentos.
Sr. Test e Sra. Test - Pais de Johnny, Susan e Mary. O Sr. Test trabalha como dono de casa sendo bastante rude e severo com seus filhos sempre os castigando por qualquer coisa. Enquanto que a Sra. Test trabalha em escritório, sendo bastante ocupada e passando pouco tempo em casa.
Gil-Sam - Vizinho bonitão de Johnny, Susan e Mary. Possui 15 anos e tem fama de galã tanto que Susan e Mary são apaixonadas por ele,mesmo que ele nem note suas existências.
Sr. Claro e Sr. Moreno - Dois agentes secretos bastante incopetentes aliados de Johnny e suas irmãs. Sempre contam com a ajuda de Johnny e os experimentos de Susan e Mary para salvarem o dia.
Sissy Blakely - Uma garota rival de Johnny. Possui 11 anos e possui um cabelo loiro com um raio vermelho no centro. Sempre tenta ser melhor que o Johnny em tudo, mas no fundo ela possui uma paixão secreta por ele.
General - Chefe do Sr. Claro e Sr. Escuro. Um homem rude que trabalha em um exército e sempre manda seus dois agentes em missões.
Bumper - O maior valentão da escola de Johnny que apesar de ser malvado demonstra ter um lado frágil e gentil em alguns episódios.
Sr. Theacherman - Professor da escola de Johnny. Aparentemente não gosta de Johnny e vive dando notas baixas pra ele
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